Interprétation des principes des tests RTPCR et risque de COVID-19

Alors que la pandémie de COVID-19 continue de présenter des défis mondiaux, les tests RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) restent la référence en matière de diagnostic de l’infection par le SRAS-CoV-2. Mais combien comprennent réellement les principes scientifiques qui se cachent derrière cet outil de diagnostic crucial ? Cet article fournit une explication détaillée mais accessible des tests RT-PCR, aidant ainsi les professionnels de la santé et le grand public à mieux comprendre cette technologie vitale.

La RT-PCR, ou Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, est une technique de biologie moléculaire très sensible et rapide utilisée pour détecter du matériel génétique spécifique dans des échantillons. Ce matériel génétique peut provenir d’humains, de bactéries ou de virus comme le SRAS-CoV-2.

La technologie de base derrière la RT-PCR est la PCR, inventée par Kary B. Mullis dans les années 1980 (ce qui lui a valu un prix Nobel). La PCR amplifie et détecte des cibles ADN spécifiques. Des améliorations ultérieures ont permis la visualisation et la quantification « en temps réel » des cibles d'ADN pendant l'amplification. Dans la PCR en temps réel, l’intensité de la fluorescence des sondes spécialisées est en corrélation avec la quantité d’ADN amplifié.

Cependant, la PCR standard ne détecte que l'ADN. Puisque le SRAS-CoV-2 contient du matériel génétique d’ARN, le test nécessite une enzyme transcriptase inverse pour convertir l’ARN en ADN complémentaire (ADNc). Cette étape de transcription inverse, combinée à la PCR en temps réel, fait de la RT-PCR un outil puissant pour détecter les virus à ARN comme le SARS-CoV-2.

Comprendre la RT-PCR nécessite des connaissances de base sur le matériel génétique, le manuel d'instructions qui régit le comportement, la survie et la reproduction cellulaire et virale. Le matériel génétique se présente sous deux formes principales : l'ADN (acide désoxyribonucléique) et l'ARN (acide ribonucléique). L'ADN présente une structure double brin tandis que l'ARN est simple brin. À des fins de diagnostic, la plus grande stabilité de l'ADN le rend préférable pour les tests de maladies infectieuses. Notamment, le SRAS-CoV-2 ne contient que de l’ARN.

Tous les virus partagent la caractéristique de dépendre des cellules hôtes pour leur survie et leur réplication. Le SRAS-CoV-2, comme d’autres virus, envahit les cellules saines pour se reproduire. Lorsqu’une infection survient, le virus libère son ARN et détourne la machinerie cellulaire pour se répliquer. Tant que le matériel génétique viral reste dans les cellules, la RT-PCR peut détecter l’infection par le SRAS-CoV-2.

Des agents de santé qualifiés collectent des échantillons nasopharyngés sur écouvillon, qui sont ensuite placés dans des tubes stériles contenant un milieu de transport viral pour préserver l’intégrité virale.

En laboratoire, les chercheurs extraient l’ARN à l’aide de kits de purification commerciaux. L’échantillon d’ARN est ensuite ajouté à un mélange réactionnel contenant tous les composants nécessaires au test, notamment l’ADN polymérase, la transcriptase inverse, les éléments constitutifs de l’ADN et les sondes et amorces fluorescentes spécifiques au SRAS-CoV-2.

Étant donné que la PCR ne fonctionne qu'avec des modèles d'ADN, la transcriptase inverse convertit tous les ARN de l'échantillon (y compris l'ARN humain, bactérien, d'autres coronavirus et potentiellement l'ARN du SRAS-CoV-2) en ADNc.

Ce processus implique trois étapes répétitives :

• Dénaturation:Chauffer l'ADN à >90°C pendant environ 10 minutes sépare l'ADN double brin en simples brins.
• Recuit d'apprêt :Des fragments d'ADN courts (amorces) spécialement conçus se fixent à des cibles spécifiques de l'ADNc du SRAS-CoV-2 à des températures plus basses. Les cibles génétiques courantes du COVID-19 comprennent l’ARN polymérase ARN-dépendante (RdRP), ORF1ab, le gène S (protéine de pointe), le gène N (nucléocapside) et le gène E (enveloppe).
• Extension:L'ADN polymérase utilise des amorces comme points de départ pour créer des copies identiques des segments d'ADN cibles.

Le processus se répète généralement 40 fois, doublant l’ADN cible à chaque cycle. Les sondes fluorescentes se lient en aval des amorces, libérant des signaux détectables à chaque amplification d'ADN. L’augmentation de l’ADN cible est en corrélation avec l’augmentation de l’intensité de la fluorescence.

Les données de fluorescence génèrent une valeur « Cycle Threshold » (Ct) : le nombre de cycles nécessaires pour que le signal dépasse les niveaux de fond. Les échantillons contenant plus d’ADN cible s’amplifient plus rapidement, nécessitant moins de cycles (valeurs Ct plus faibles). À l’inverse, un ADN cible rare nécessite plus de cycles (valeurs Ct plus élevées).

Les valeurs Ct fournissent des informations cruciales sur la charge virale. Des valeurs Ct plus faibles indiquent des quantités plus élevées de génome viral, tandis que des valeurs plus élevées suggèrent des quantités plus faibles. Les prestataires de soins combinent les valeurs Ct avec les symptômes cliniques et les antécédents pour évaluer le stade de la maladie. Les valeurs Ct en série issues de tests répétés aident à surveiller la progression de la maladie et à prédire la guérison. Les traceurs de contacts utilisent également les valeurs Ct pour donner la priorité aux patients présentant la charge virale la plus élevée (et donc le plus grand risque de transmission).

• Charge virale :Les valeurs de Ct sont inversement corrélées à la charge virale : un Ct plus faible signifie une plus grande présence de virus.
• Stade de la maladie :L’infection précoce montre généralement des charges virales élevées (faible Ct), tandis que les stades ultérieurs montrent une baisse des charges (augmentation du Ct) à mesure que le système immunitaire élimine l’infection.
• Risque de transmission :Des charges virales plus élevées (valeurs Ct plus faibles) indiquent un potentiel de transmission plus élevé, justifiant des mesures d’isolement plus strictes.

Bien qu’elle soit la référence en matière de diagnostic du COVID-19, la RT-PCR présente des limites :

• Faux négatifs :Un échantillonnage inapproprié, une faible charge virale ou des tests précoces peuvent produire des résultats négatifs malgré une infection réelle.
• Faux positifs :Résultats positifs rares mais possibles sans infection réelle.
• Défis de la normalisation :Différents laboratoires et plates-formes peuvent utiliser différents seuils de Ct, ce qui complique les comparaisons.

Les tests RT-PCR restent essentiels pour le diagnostic du COVID-19 en détectant le matériel génétique du SRAS-CoV-2. Les valeurs Ct servent d’indicateurs vitaux de la charge virale, de la progression de la maladie et du risque de transmission. Cependant, les limites des tests nécessitent de combiner les résultats avec une évaluation clinique pour un diagnostic et une prise en charge précis.